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和记TiBS:发表关于cryo-ET解析囊膜病毒结构的研究

作者:bob 时间:2021-09-19 04:09

  囊膜病毒门类浩瀚,此中不乏名誉扫地之辈,比方埃博拉病毒(Ebola),艾滋病病毒(HIV),流感病毒(influenza),和新冠病毒等(SARS-CoV-2 virus)。研讨其构造、入侵机制和性命周期是针对性开辟疫苗、抗体和药物的根底,不断是构造生物学热门。但囊膜病毒的多态性给传统构造生物学手腕带来很多费事,其较小的尺寸(直

  囊膜病毒门类浩瀚,此中不乏名誉扫地之辈,比方埃博拉病毒(Ebola),艾滋病病毒(HIV),流感病毒(influenza),和新冠病毒等(SARS-CoV-2 virus)。研讨其构造、入侵机制和性命周期是针对性开辟疫苗、抗体和药物的根底,不断是构造生物学热门。但囊膜病毒的多态性给传统构造生物学手腕带来很多费事,其较小的尺寸(直径~100nm)也给在细胞内间接察看这些病毒的性命举动带来了应战(图1)。回忆已往20年来,cryo-ET手艺与构造病毒学协同开展,互相增进:为在静态组装、多形的囊膜病毒上间接剖析高分辩卵白构造,份子cryo-ET标的目的向高通量、高分辩标的目的开展;为一窥病毒在细胞中的性命举动,细胞cryo-ET标的目的新型特同性生物标识表记标帜、冷冻光电结合成像(cryo-CLEM)、冷冻聚焦离子束减薄(cryo-FIB milling)等标的目的开展。2020年,cryo-ET为片面展现新冠病毒完好构造、组装纪律、病变细胞构造等方面做出了杰出的奉献,已在顶尖刊物揭晓多篇文章,此中包罗2020年9月李赛尝试室剖析的完好新冠病毒三维构造。这些事情不只为病毒学、疫苗、抗体研讨供给了高分辩构造信息,也为科普、防疫等带来大批实在精确的影象质料。

  清华大门生命科学学院李赛副传授应邀在国际出名学术期刊Trends in Biochemical Sciences的冷冻电镜特刊揭晓题为《囊膜病毒研讨中的冷冻电镜断层成像手艺》(Cryo-electron tomography of enveloped viruses)的综述文章,体系总结了cryo-ET在剖析囊膜病毒构造,提醒其组装和性命周期机制等研讨中的使用。文章也体系总结了比年来cryo-ET手艺在各方面的提拔及使用范畴的扩大,并对范畴将来停止了瞻望。

  原位构造生物学的目的是将超大卵白质机械从生物膜、病毒、细胞、以至构造情况中间接剖析,以得到其在体构造、与核酸/生物膜的互作干系及散布信息。原位构造生物学中心手艺是cryo-ET:它是将置于透射电镜样品台上的冷冻样品沿牢固轴扭转,并从多个角度照相得到倾转系列(tilt series, TS),将其重构为三维断层图象,再利用子断层均匀法(sub-tomogram averaging, STA)停止构造剖析的新型构造生物学办法。已往10年,为处理差别标准的构造生物学成绩,cryo-ET范畴也开辟出一系列样品制备、卵白定位、数据阐发等配套手艺,它们包罗:快速投入式冷冻制样、高压冷冻制样、冷冻光电结合成像(cryo-CLEM)、电镜可见的特同性生物标识表记标帜、冷冻聚焦离子束减薄(cryo-FIB milling)、相位板(VPP)、基于野生智能的图象辨认、降噪和图形朋分等。当今,cryo-ET不再仅指收罗倾转系列数据的办法,而成为一种包纳上述多种前沿手艺的自力的构造生物学标的目的。

  比拟传统的冷冻电镜办法,cryo-ET的原始数据增长了准确的Z轴信息,因而对样品纯度及组装严厉性请求较低,且在制备样品过程当中无需使其离开原生情况,得到的构造更具心理意义。跟着它的日趋完美,从病毒到细菌、细胞以至构造维度间的构造生物学空缺将获得弥补(图2)。

  Cryo-ET剖析卵白质复合物高分辩构造需求搜集含无数万个目的复合物的照片,因而,在细胞等原位情况中高效的寻觅目的复合物是原位构造生物学的条件。但是,卵白质复合物、病毒与细胞、构造之间存在宏大的尺寸差别,并且细胞内部情况极其拥堵、喧闹,这给寻觅目的复合物带来了宏大应战。举例阐明,因为尺寸比例近似,在细胞中找到一颗病毒的难度比如在傍晚时尽是人群的足球场找到一颗足球。因而,仅利用冷冻电镜在细胞中“碰命运”式的寻觅目的复合物将极其低效。今朝有多种计划处理这个成绩,目的均是在细胞中完成单份子的定位精度,它们可分为两类:1)新型特同性生物标识表记标帜;2)CLEM将光学显微镜与电镜联系关系。

  李赛在综述中体系论述了cryo-ET和STA怎样作为囊膜病毒研讨的有力东西。Cryo-ET手艺不只能重构病毒的完好构造组装(图1),还可供给构成病毒的各种构造卵白的原位高分辩构造,如糖卵白、基质卵白等。此中病毒外表糖卵白是病毒入侵细胞的枢纽份子、免疫防备的主要靶标,因此在构造卵白研讨中最受存眷。Cryo-ET手艺则供给了有关糖卵白的度原位构造信息。比方,cryo-ET发明新冠病毒外表刺突卵白可在病毒外表以一个较大的角度停止摆动;又如,丙型流感病毒外表糖卵白HEF会在原位构成六聚的高聚构造,使得在原位上,HEF卵白的头部比晶体构造中有更多的扭转和扩展(图3)。这些原位构造的剖析为疫苗、抗体的研发供给了病毒在自然形态下的更多细节。

  同时,文章翔实归结了cryo-ET手艺是怎样奉献于体外模仿膜交融、及交融过程当中糖卵白构象变革的相干研讨。比方,传统的构造研讨办法限定了糖卵白不克不及处于原位的膜情况、从而低落理解析膜交融历程的牢靠性,而cryo-ET手艺刚好补偿了这一缺憾。李赛曾操纵酸化孵育前提引诱裂谷热病毒糖卵白发作构象变革、介导与脂质体发作膜交融,并使用cryo-ET手艺胜利在孵育30秒的工夫点捕获并剖析了裂谷热病毒糖卵白变构插入脂质体的中心构造。由此能够窥见cryo-ET手艺使得更多庞大体外前提的构造剖析变成能够,展示了广大的使用处景。

  研讨病毒的性命周期:入侵,开释基因组,和记首页复制,组装,开释等不断以来是病毒学研讨的重点和难点,也为抗病毒靶点的挑选与抗病毒机制的研讨供给了根据。李赛研讨员在综述中体系论述了cryo-ET在察看病毒性命周期中的使用功效。比方操纵cryo-ET研讨公理链RNA病毒发明,这些病毒大大都在传染细胞后会改动细胞的膜体系,从而在胞内构成一类被称为“病毒工场”的囊泡构造来停止病毒核酸的复制。

  综述不只对囊膜病毒的构造研讨停止了详尽的梳理,也归结了今朝份子、细胞cryo-ET手艺在制样、标识表记标帜、数据收罗和处置上屡见不鲜的新手艺。跟着这些手艺的开辟,cryo-ET手艺在将来具有愈加宽广的使用远景。但是,很多手艺今朝仍在探究阶段,另有太多空间能够拓展。作为一门年青的手艺,cryo-ET在每一年揭晓的电镜构造里仅做出不到20%的奉献:次要是因为其采样费时,图象处置办法不完美等缘故原由所招致的低分辩率(~20-40?),这同样成为该范畴亟待处理的困难。李赛及其团队在已往的九年里不断努力于进步cryo-ET手艺的分辩率和易用性,力争处理今朝cryo-ET构造剖析过程当中的低效、手动、出息修曲线、低分辩等难点,并主动在国表里推行cryo-ET手艺。(生物谷

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